當(dāng)我們已經(jīng)驗(yàn)證過HCP ELISA與樣品基質(zhì)的兼容性，并且找到了樣品的最低需求稀釋度（MRD）后，那么下一步就是驗(yàn)證ELISA方法的精密度，進(jìn)而完成法規(guī)要求的ELISA方法學(xué)驗(yàn)證的全部流程。

什么是精密度和重復(fù)性？

精密度是指多次檢測結(jié)果之間的一致性程度，通常以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性進(jìn)行評估，以變異系數(shù)（%CV）來表示。

計(jì)算公式：%CV=(標(biāo)準(zhǔn)差/平均濃度)×100%

通過此公式，可以評估兩種精密度：

批內(nèi)精密度：衡量單次實(shí)驗(yàn)內(nèi)不同復(fù)孔之間的重復(fù)性。嚴(yán)格的批內(nèi)CV表明樣品讀數(shù)不受加樣位置或操作程序的影響。

批間精密度：衡量多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之間的重復(fù)性。確保批間CV在可接受范圍內(nèi)（通常＜15-20%，取決于法規(guī)要求）是證明該方法能持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)出可靠結(jié)果的關(guān)鍵指標(biāo)。

法規(guī)要求

?      ICH Q2(R1)

方法：在3個(gè)濃度水平下至少進(jìn)行9次測定，覆蓋該測定的分析范圍（在3個(gè)濃度下進(jìn)行3次重復(fù)）

標(biāo)準(zhǔn)：未說明。

?      US FDA

方法：至少在3個(gè)濃度水平下進(jìn)行5次測定，覆蓋該測定的分析范圍（在3個(gè)濃度下進(jìn)行5次重復(fù)）

標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)濃度水平下精密度的CV%應(yīng)在±20%范圍內(nèi)，LLOQ的CV%不應(yīng)超過25%。

?      EMA

方法：在4種濃度下至少進(jìn)行5次測定(在LLOQ、LLOQ的三倍以內(nèi)、標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度的30-50%、ULOQ的至少75%，4種濃度下進(jìn)行5次重復(fù)）。

標(biāo)準(zhǔn)：每一濃度水平質(zhì)控的批內(nèi)和批間精密度均不應(yīng)超過15%，LLOQ的CV%不應(yīng)超過20%。

常見問題排查：導(dǎo)致CV值偏高的原因

如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果的CV值高于試劑盒說明書中的預(yù)期范圍，那么很可能是操作流程或設(shè)備出現(xiàn)了問題，我們建議您按以下步驟進(jìn)行問題排查與實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1. 洗板操作

問題原因：

過度劇烈的洗板是CV值異常偏高的常見原因，包括使用自動洗板機(jī)、用力拍板等操作，因其可能導(dǎo)致抗原-抗體復(fù)合物發(fā)生非特異性解離，進(jìn)而造成CV值過高。

優(yōu)化建議：

為實(shí)現(xiàn)最佳重復(fù)性，我們強(qiáng)烈推薦洗瓶洗板法，可以通過交替方向加入洗液來確保每個(gè)孔的清洗時(shí)間保持基本一致。有關(guān)洗板的詳細(xì)操作請參考下文。
如何用正確的洗板方法解決ELISA檢測結(jié)果漂移的問題？

2. 酶標(biāo)儀性能

問題原因：

當(dāng)在低吸光度范圍（如OD值＜0.1）的檢測值出現(xiàn)較大波動時(shí)，可能提示酶標(biāo)儀存在潛在問題。光源、單色器或?yàn)V光片的故障可能導(dǎo)致間歇性信號異常或噪聲，此類問題通常無法通過常規(guī)校準(zhǔn)程序識別，但會對檢測的靈敏度以及定量限（LOQ）和檢測限（LOD）產(chǎn)生顯著影響。該類問題常表現(xiàn)為在空白孔或僅含有非吸附性液體的孔中，孔與孔之間OD值讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到0.020或更低。

優(yōu)化建議：

對于HRP-TMB顯色的ELISA，推薦使用雙波長讀數(shù)（如檢測波長450nm，參比波長650nm）。通過雙波長讀數(shù)法，可從檢測波長（如450nm）處的信號值中扣除非特異性信號（如650nm處的背景OD值），從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。該方法可以最大限度地減少因污漬或塑料缺陷引起的孔間差異，從而提升精密度與準(zhǔn)確度。

（注：質(zhì)量良好的板條在參比波長（如650nm）的OD值通常很低（平均約0.040），且孔間OD值標(biāo)準(zhǔn)差極?。s0.002）。若實(shí)際檢測OD值遠(yuǎn)高于0.040且標(biāo)準(zhǔn)差大于0.004，則表明酶標(biāo)儀可能存在問題。）

3. 試劑污染

問題原因：

Cygnus的ELISA試劑盒靈敏度高達(dá)pg/mL至ng/mL級別，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中潛在的高濃度分析物（如培養(yǎng)基、上游工藝樣品中的HCP或BSA，濃度可達(dá)mg/mL級），非常容易對試劑盒中的關(guān)鍵組分造成污染，如果檢測結(jié)果出現(xiàn)孔板中個(gè)別孔吸光值偏差過大，且同一個(gè)試劑盒重復(fù)后偏差數(shù)據(jù)值相似，則可能是孔板的孔、標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)抗體出現(xiàn)了污染。

優(yōu)化建議：

盡可能在遠(yuǎn)離處理上游樣品的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)操作，避免交叉使用移液器，做好操作臺面與儀器的清潔，盡可能使用帶有濾芯的吸頭等。

4. 分析人員與儀器

問題原因：

操作不規(guī)范，移液器未校準(zhǔn)或使用質(zhì)量不達(dá)標(biāo)的吸頭，均可能對檢測結(jié)果的精密度產(chǎn)生不利影響。

優(yōu)化建議：

邀請另一位分析人員在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室中使用不同設(shè)備進(jìn)行平行測試，可能有助于您確定精密度不理想的原因是由于操作人員缺乏經(jīng)驗(yàn)，還是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室工具存在問題，比如移液器未校準(zhǔn)或吸頭質(zhì)量差。

成功完成ELISA方法的精密度與重復(fù)性驗(yàn)證，是確保數(shù)據(jù)可靠、推動項(xiàng)目前進(jìn)的基石。Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息索取，或直接聯(lián)系Cygnus中國總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過程中遇到任何問題，我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)將竭誠為您提供解決方案和建議。

Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測超過50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。

北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。如您對上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站www.7daysinn.net了解更多信息。